文中對表達(dá)FUCCI2的腸類器官進(jìn)行了活體成像，并進(jìn)行了終點固定和免疫熒光評估其細(xì)胞類型組成。通過3D配準(zhǔn)將最后一個活體成像時間點與染色后的類器官疊加，使用Paneth細(xì)胞標(biāo)記溶菌酶（Lys）和分泌細(xì)胞標(biāo)記Dll1來檢測感興趣的細(xì)胞。三重陽性細(xì)胞（hCdt1+/Lys+/Dll1+）被反向追蹤以監(jiān)測Paneth細(xì)胞的成熟及其在G0/G1期的細(xì)胞周期停滯。成熟Paneth細(xì)胞的初始位置預(yù)測了類器官隱窩的最終位置。

接下來，比較了隱窩中的hCdt1+/Lys+/Dll1+ Paneth細(xì)胞與hCdt1+/Lys?/Dll?細(xì)胞（主要是腸干細(xì)胞）和類器官絨毛中的細(xì)胞（主要是腸細(xì)胞）。進(jìn)一步識別了那些在記錄開始前已經(jīng)終末分化的腸細(xì)胞和Paneth細(xì)胞。對于其他細(xì)胞，特別是在隱窩中的細(xì)胞，確定了它們出現(xiàn)的時間，從而能夠追蹤它們的完整成熟過程，固定時的平均細(xì)胞周期長度為21.9小時。評估細(xì)胞類型特定的出現(xiàn)時間，得出結(jié)論，Paneth細(xì)胞比單陽性hCdt1細(xì)胞出現(xiàn)得更早，表明特定的細(xì)胞周期長度和特定的分化順序。這種對細(xì)胞行為和成熟過程的洞見在沒有活體成像和免疫熒光結(jié)合整個類器官體積的情況下是無法實現(xiàn)的。

與其他樣本不同，胚狀體是密集結(jié)構(gòu)，因此難以單細(xì)胞分辨率成像。文中使用這個模型系統(tǒng)展示顯微鏡獲取單個細(xì)胞運動和形態(tài)特征的能力。標(biāo)準(zhǔn)胚狀體實驗方案使用Wnt激活劑（Chiron99021）以提高中胚層形成效率。這可能會誘導(dǎo)類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的行為并增加細(xì)胞遷移。為了分析胚狀體內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)，文中生成了嵌合體，其中一部分細(xì)胞（約10%）表達(dá)膜報告基因（Lck-GFP）。記錄胚狀體在Wnt脈沖前、中和后的動態(tài)。此外，將胚狀體嵌入40%的Matrigel中，以防止樣本腔室中的機械旋轉(zhuǎn)。使用Cellpose對單個細(xì)胞進(jìn)行3D分割，從而計算長軸/短軸比率，顯示細(xì)胞伸長在Chir處理期間達(dá)到峰值。

后期階段，部分細(xì)胞顯示出較長的細(xì)胞突起。這一觀察結(jié)果提出了細(xì)胞運動性在胚狀體發(fā)育過程中增加的假設(shè)。使用Fiji插件Mastodon，追蹤了Lck-GFP陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)遷移的中位速度在胚狀體發(fā)育過程中增加。在Wnt脈沖期間，遷移速度的中位數(shù)增加了1.4倍。Wnt激活后成像的胚體展示了最長的軌跡長度。對3D均方位移的評估表明，從90小時開始追蹤的細(xì)胞速度增加，并且遷移行為發(fā)生了變化。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，遷移增加，提示W(wǎng)nt激活增強了細(xì)胞運動性并可能在胚體中促進(jìn)了協(xié)調(diào)遷移。觀察到的細(xì)胞形態(tài)變化和運動性增加，部分表明了類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。這一趨勢在嵌入Matrigel中的胚體和懸浮狀態(tài)下的胚體之間保持一致。

開放式設(shè)計和可定制的樣本支架提供了處理不同類型樣本和實驗設(shè)置的靈活性。這種適應(yīng)性使顯微鏡適用于從類器官研究到發(fā)育生物學(xué)和癌癥研究的廣泛生物學(xué)研究。

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡代表了實時成像技術(shù)的重大進(jìn)展。未來的增強可能包括整合自適應(yīng)光學(xué)以進(jìn)一步提升圖像質(zhì)量，以及結(jié)合激光消融或光遺傳刺激技術(shù)以在成像過程中操縱樣本。此外，該系統(tǒng)處理光學(xué)透明標(biāo)本的能力可能擴展其在深層組織成像中的應(yīng)用。

開放式多樣本雙視角光片顯微鏡的開發(fā)和成功應(yīng)用標(biāo)志著生物成像領(lǐng)域的關(guān)鍵一步。通過在長時間內(nèi)提供大型多細(xì)胞系統(tǒng)的高分辨率三維圖像，這一技術(shù)為理解細(xì)胞水平上的復(fù)雜生物過程開辟了新的途徑。