了解自發(fā)熒光的常見(jiàn)原因以及如何將其從共聚焦顯微鏡圖像中去除。根據(jù)應(yīng)用的不同，自發(fā)熒光的來(lái)源可能有很多種，但幸運(yùn)的是，同樣也有很多的解決方案--從更換介質(zhì)到使用熒光壽命成像和近紅外染料。

引 言

熒光顯微鏡改變了我們對(duì)生物學(xué)的理解。在細(xì)胞內(nèi)以高空間分辨率定位特定分子事件的能力使人們對(duì)從基因表達(dá)通路到藥物相互作用的一切都有了深入的了解。

隨著現(xiàn)代共聚焦顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步，其靈敏度也在不斷提高。就像任何高靈敏的測(cè)量一樣，一個(gè)根本的問(wèn)題是信噪比，背景噪聲可能會(huì)掩蓋信號(hào)中的微小變化。

在熒光共聚焦顯微鏡中，最大的噪聲源之一是自發(fā)熒光。去除這種背景對(duì)于能夠理解樣本中存在的信號(hào)的細(xì)微差別是至關(guān)重要的。在這篇綜述中，我們將探索如何通過(guò)一些快速固定方法和一些現(xiàn)代技術(shù)，如熒光壽命成像，來(lái)消除自發(fā)熒光，這些技術(shù)在軟件和顯微硬件的進(jìn)步下變得更容易使用。

自發(fā)熒光產(chǎn)生的原因

自發(fā)熒光有許多潛在的原因，而且在單個(gè)樣品中通常有多個(gè)來(lái)源。首先，細(xì)胞本身可能是內(nèi)源性自發(fā)熒光的來(lái)源。一些常見(jiàn)的來(lái)源是NADH，黃素，脂褐素，膠原和彈性蛋白，以及植物樣品中的葉綠素和木質(zhì)素。換句話說(shuō)，他們很難擺脫。

除了細(xì)胞自身組分帶來(lái)的自發(fā)熒光外，樣品在成像前的處理過(guò)程也會(huì)引入額外的背景熒光。這可以是任何東西，從藥物處理到封片劑。在嘗試去除自發(fā)熒光之前，確定其來(lái)源是很重要的。

消除自發(fā)熒光的方法

01了解你的樣品

如果你遇到了自發(fā)熒光的問(wèn)題，首先要做的是嘗試通過(guò)調(diào)查你的樣本來(lái)隔離根源。當(dāng)你開(kāi)始你的實(shí)驗(yàn)時(shí)，制備一個(gè)未標(biāo)記的對(duì)照樣品，以確定染色過(guò)程是否會(huì)帶來(lái)背景熒光。

了解你的自發(fā)熒光光譜也很重要。這可以使用光譜掃描來(lái)確定。光譜掃描將有助于實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和避免自發(fā)熒光中的強(qiáng)信號(hào)區(qū)。

02優(yōu)化熒光團(tuán)亮點(diǎn)

一旦你對(duì)你的自發(fā)熒光光譜有了一個(gè)很好的了解，下一步就是優(yōu)化你的熒光團(tuán)選擇。如果自發(fā)熒光和你的熒光團(tuán)的光譜非常緊密地重疊，那么你的信號(hào)很有可能會(huì)被自發(fā)熒光所掩蓋。在這種情況下，選擇光譜遠(yuǎn)離背景自發(fā)熒光的熒光團(tuán)。例如，如果你的自發(fā)熒光在光譜的藍(lán)色區(qū)域，把你的熒光團(tuán)移到綠色或紅色。

在選擇熒光團(tuán)時(shí)，請(qǐng)選擇新型探針，如Alexa Fluor、Dylight或ATTO。這些染料往往更亮、更穩(wěn)定，而且激發(fā)和發(fā)射波段更窄，這使得只從熒光團(tuán)中選擇信號(hào)變得更容易。如果你的顯微鏡能檢測(cè)到它們，近紅外染料是避免自發(fā)熒光問(wèn)題的一個(gè)很好的方法，因?yàn)檫@些波長(zhǎng)在生物樣本中很少發(fā)現(xiàn)。能夠檢測(cè)到近紅外染料還有一個(gè)額外的好處，那就是能夠擴(kuò)大可用于多色實(shí)驗(yàn)的通道數(shù)量。

選擇熒光團(tuán)后，不要盲目使用包裝上列出的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這一點(diǎn)很重要。通常情況下，需要對(duì)熒光團(tuán)進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)，在你的樣本上測(cè)試不同的濃度。這可以讓你看看哪種濃度能夠獲得超好的背景反差，哪種濃度能夠獲得很低的自發(fā)熒光。使用制造商的說(shuō)明書(shū)作為指南，建立熒光團(tuán)的稀釋梯度，覆蓋范圍略大于推薦的范圍。對(duì)照你的樣品測(cè)試這些稀釋液，找出哪個(gè)能給你最合適的信號(hào)。

03優(yōu)化您的顯微鏡設(shè)置

共聚焦顯微鏡上的設(shè)置能夠大大影響在你的圖像中的目標(biāo)信號(hào)和自發(fā)熒光。您可以通過(guò)調(diào)整光譜檢測(cè)范圍來(lái)盡可能多地減少自發(fā)熒光信號(hào)。根據(jù)顯微鏡的不同，有不同的方法可以做到這一點(diǎn)，但最靈活的選擇是選擇白激光和光譜式檢測(cè)器。這意味著你可以精確地調(diào)節(jié)到達(dá)樣品的和檢測(cè)器的光的波長(zhǎng)以及通過(guò)檢測(cè)器的波長(zhǎng)?？梢詫?duì)記錄在捕獲圖像中的信號(hào)時(shí)進(jìn)行非常精細(xì)的控制，并提供充分的機(jī)會(huì)來(lái)消除自發(fā)熒光。

圖1：當(dāng)比較自發(fā)熒光和熒光團(tuán)的光譜時(shí)，選擇一個(gè)與自發(fā)熒光信號(hào)不重疊的熒光團(tuán)。

04處理你的樣本

自發(fā)熒光通常不是來(lái)自樣本，而是來(lái)自成像前的處理過(guò)程。例如包埋劑、組織培養(yǎng)液和塑料器皿都可能是自發(fā)熒光的來(lái)源。

如果你正在進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，那么考慮在成像前用預(yù)熱的無(wú)酚紅培養(yǎng)基或透明的緩沖鹽水溶液替換你的正常培養(yǎng)液。除了pH指示劑酚紅(440 nm可以激發(fā)出高強(qiáng)度熒光)外，培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑(如FBS)還可以包含許多蛋白質(zhì)和小分子，它們本身就有熒光信號(hào)，如果不去除它們，所有這些都可以形成強(qiáng)大的自發(fā)熒光背景。如果您確實(shí)決定將細(xì)胞切換到一種新的培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，重要的是要意識(shí)到這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞行為和表型發(fā)生意想不到的變化，因此根據(jù)您正在研究的內(nèi)容，您可能需要首先使細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

用同樣的顯微鏡裝置預(yù)先測(cè)量培養(yǎng)皿的自發(fā)熒光也是必要的，看看這是否是自發(fā)熒光的來(lái)源。如果是這樣的話，試著去除自發(fā)熒光的玻璃底培養(yǎng)皿。

在對(duì)暴露于化學(xué)物質(zhì)的活檢和組織樣本進(jìn)行成像時(shí)，也可以看到類似的問(wèn)題。一個(gè)常見(jiàn)的例子是消化道，如果它暴露在具有強(qiáng)烈熒光特征的抗生素(如四環(huán)素)中，它可能會(huì)有大量的自發(fā)熒光。在這種情況下，用緩沖鹽水沖洗或小心使用溶劑就可以很容易地去除熒光。

如果你需要固定細(xì)胞，固定方法會(huì)對(duì)自發(fā)熒光有很大的影響?？紤]使用福爾馬林和戊二醛的替代品，在成像前盡量不要儲(chǔ)存固定樣本太長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)樽园l(fā)熒光會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加。

05軟件

雖然通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)避免自發(fā)熒光是很好的，但有時(shí)這是不可能的。在這些情況下，可以通過(guò)計(jì)算解決你的自發(fā)熒光問(wèn)題。使用您的顯微鏡軟件或開(kāi)源解決方案(如ImageJ)，可以分析包含自發(fā)熒光的像素，并嘗試將其從整體圖像中減去[1]。不過(guò)，請(qǐng)注意，計(jì)算方法可能很復(fù)雜。有許多不同的方法和算法可供選擇，所以建議多嘗試幾種方法和算法，看看哪種效果好。重要的是要記住，這些方法通常會(huì)降低熒光團(tuán)信號(hào)和自發(fā)熒光的強(qiáng)度，所以要小心使用，要知道在增加背景的對(duì)比度和降低信號(hào)強(qiáng)度之間通常是需要權(quán)衡的。

06固定后去除自發(fā)熒光

一旦你準(zhǔn)備好樣品并將其儲(chǔ)存在冰箱里，就會(huì)覺(jué)得任何自發(fā)熒光都會(huì)一直存在。雖然在樣品制備階段消除自發(fā)熒光比較容易，但即使在處理后也可以采取一些步驟。

有許多化學(xué)處理方法可以減弱自發(fā)熒光信號(hào)。其中一些是商品化可以買(mǎi)到的，而另一些則可以很容易地用常用的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品如蘇丹黑B、乙醇銨等來(lái)制備[2，3]。

在顯微鏡下，光漂白往往具有負(fù)面含義，在激光調(diào)得稍高的情況下，花了很長(zhǎng)時(shí)間尋找最佳圖像后，會(huì)失去熒光信號(hào)。然而，對(duì)于自發(fā)熒光，漂白可以是你的朋友。在添加熒光團(tuán)之前，您可以用高強(qiáng)度LED燈處理您的樣品，以漂白所有的背景自發(fā)熒光。之后，您選擇的熒光團(tuán)應(yīng)該能與漂白的背景形成更強(qiáng)烈的對(duì)比[4]。

去除自發(fā)熒光的進(jìn)階方法

顯微鏡和熒光成像技術(shù)在考慮到自發(fā)熒光的情況下不斷進(jìn)步。在商用共聚焦顯微鏡中，有兩項(xiàng)創(chuàng)新正變得更加容易獲得。

01白激光

當(dāng)涉及到減少自發(fā)熒光時(shí)，白激光(WLL)提供了很大的靈活性。首先，它們使您能夠微調(diào)您的激發(fā)波長(zhǎng)，以匹配您選擇的熒光團(tuán)，同時(shí)補(bǔ)充您的樣品的自發(fā)熒光光譜。

當(dāng)涉及到熒光團(tuán)的選擇時(shí)，白激光也為您提供了最大的靈活性，因?yàn)閺睦碚撋现v，它們可以讓您使用所有已知的光譜熒光染料。波長(zhǎng)從440 nm一直到近紅外端(790 nm)，在處理自發(fā)熒光時(shí)，激發(fā)近紅外熒光團(tuán)的能力特別有利，而自發(fā)熒光更常見(jiàn)于光譜的藍(lán)色和綠色波段。

最后，基于光纖的WLL技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)脈沖激發(fā)，因此您可以在脈沖之間非常短的間隔內(nèi)記錄熒光信號(hào)(計(jì)算光子數(shù))。這是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)的基本要求，TCSPC是熒光壽命分析的金標(biāo)準(zhǔn)方法。有了WLL功能，F(xiàn)LIM可以內(nèi)置到您的顯微鏡設(shè)置中，提供一種非常有效和相對(duì)簡(jiǎn)單的方法來(lái)減少自發(fā)熒光和提高圖像對(duì)比度。

02熒光壽命成像

熒光壽命成像方法可用于消除自發(fā)熒光。壽命測(cè)量不只依賴于給定波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，而是反映了熒光團(tuán)處于激發(fā)狀態(tài)的時(shí)間，這通常是納秒級(jí)的。這是非常有用的，因?yàn)槟愕谋尘白园l(fā)熒光和你的熒光團(tuán)有重疊光譜的可能性相對(duì)較高。然而，它們具有相同壽命的可能性要小得多。這意味著壽命測(cè)量可以用來(lái)區(qū)分自發(fā)熒光和你的熒光團(tuán)信號(hào)，即使它們看起來(lái)在相同的光譜范圍內(nèi)。以這種方式區(qū)分熒光信號(hào)的能力意味著，使用壽命測(cè)量可以從幾乎任何熒光信號(hào)中收集有意義的信息，甚至包括自發(fā)熒光。雖然壽命測(cè)量傳統(tǒng)上是一項(xiàng)相對(duì)復(fù)雜的技術(shù)，但硬件和軟件的改進(jìn)使其更容易整合到任何共焦顯微鏡工作流程中。

圖2：左邊的熒光顯微鏡圖像，不能區(qū)分熒光信號(hào)和背景自發(fā)熒光。在右邊的圖像中，熒光壽命被用來(lái)區(qū)分葉綠體中的自發(fā)熒光(藍(lán)色)和所需的細(xì)胞膜熒光信號(hào)(綠色)。

總結(jié)和結(jié)論

自發(fā)熒光不一定會(huì)毀了你的實(shí)驗(yàn)

當(dāng)你只有有限數(shù)量的珍貴樣本時(shí)，重要的是不要讓任何東西影響你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。自發(fā)熒光是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，如果你聽(tīng)之任之，它可能會(huì)毀了你的實(shí)驗(yàn)。然而，對(duì)于自發(fā)熒光，有很多解決方案，從簡(jiǎn)單地改變?cè)跇悠诽幚磉^(guò)程中使用的試劑到使用技術(shù)先進(jìn)的顯微鏡和檢測(cè)器。

為自發(fā)熒光做好準(zhǔn)備是阻止它影響你實(shí)驗(yàn)的方法。通過(guò)做好準(zhǔn)備，你可以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中做出減少或消除背景熒光的選擇。

參考文獻(xiàn)：

1.J. M. Powell, N. W. Plummer, E. L. Scappini, C. J. Tucker and a. P. Jensen, ?DEFiNE: A Method for Enhancement and Quantification of Fluorescently Labeled Axons,“ Front Neuroanat, 2018.

2.W. Baschong, R. Suetterlin and R. Laeng, ?Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM).,“ J Histochem Cytochem, vol. 49, no. 12, 2001.

3.M. Viegas, T. Martins, F. Seco and A. do Carmo, ?An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues.,“ Eur J Histochem, vol. 51, no. 1, 2007.

4.S. Y, I. P and C. A, ?Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.,“ J Vis Exp, no. 127, 2017.

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