圖 3：自適應(yīng)焦點(diǎn)控制（AFC）在長期時(shí)間延遲采集過程中自動穩(wěn)定顯微鏡的焦點(diǎn)。傳感器檢測 LED 光束（850 nm）的移動，當(dāng)承載樣本的蓋玻片因熱活動等原因改變位置時(shí)，會發(fā)生這種移動。

哪種對比方法會適合您的樣本？

大多數(shù)細(xì)胞——尤其是動物細(xì)胞——在顯微鏡下觀察時(shí)沒有足夠的內(nèi)在對比度來看到細(xì)節(jié)。研究人員使用 對比方法 來解決這個問題。雖然相位對比 (PH) 和差分干涉對比 (DIC) 操控通過標(biāo)本的光線以增加對比度，但您也可以用熒光染料 （如何準(zhǔn)備您的標(biāo)本以進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察）進(jìn)行染色，或者使用熒光蛋白。

根據(jù)對比方法，顯微鏡需要特定的設(shè)備；例如，相位對比需要特殊的物鏡，而 DIC 則利用某些 棱鏡，這些棱鏡必須切換到光路中。對于熒光顯微鏡，您需要特殊的濾光塊，以允許正確的光波長進(jìn)入和離開標(biāo)本。

圖 4：采用不同對比方法獲得的一系列神經(jīng)細(xì)胞。從左到右：明場，DIC，相位對比，熒光

光源怎么樣呢？

對比方法的選擇也決定了光源。傳統(tǒng)明場顯微鏡、相位對比和 DIC 的透射光照明可以使用 鹵素或 LED 照明。熒光顯微鏡可以使用 LED 照明或借助 汞、氙或汞金屬鹵化物燈進(jìn)行。

你想記錄或發(fā)布你的結(jié)果嗎？

如果你想拍攝你的標(biāo)本或進(jìn)行活細(xì)胞成像，你需要一個數(shù)字顯微鏡相機(jī)。特別是在熒光活細(xì)胞成像的情況下，建議使用靈敏的相機(jī)，以最小化可能對細(xì)胞造成傷害的激發(fā)光量。除了成熟的CCD和EMDDC相機(jī)外，如今 sCMOS 相機(jī)因其高量子效率和采集速度而受到歡迎。有關(guān)數(shù)字顯微鏡相機(jī)的更多信息，請閱讀文章《數(shù)字相機(jī)技術(shù)簡介》。

此外，較大的 視野 (FOV) 有助于更快地找到有趣的區(qū)域，并同時(shí)成像更多的細(xì)胞。現(xiàn)代研究顯微鏡在相機(jī)端口配備了 19 毫米視野，與 19 毫米 sCMOS 相機(jī)芯片匹配。

19 毫米視場的優(yōu)勢

通常，僅僅拍攝樣本的圖像是不夠的，還需要對您獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為此，易于使用的 成像和分析軟件 有助于獲取定量數(shù)據(jù)并進(jìn)行可靠的數(shù)據(jù)分析。

你需要來自厚樣本的（3D）信息嗎？

厚樣本對顯微鏡觀察來說是一個挑戰(zhàn)。尤其是在寬場顯微鏡中，整個樣本同時(shí)被照明，識別處于焦點(diǎn)的樣本特征可能會因來自失焦區(qū)域的額外光線而顯著降低。

Computational Clearing可以幫助獲得不受失焦光影響的圖像。該技術(shù)可以應(yīng)用于單個圖像平面以獲得即時(shí)結(jié)果（ICC：即時(shí)Computational Clearing），或者可以與額外的去卷積步驟結(jié)合使用（SVCC：小體積Computational Clearing；LVCC：大體積Computational Clearing），以獲得更好的結(jié)果。去卷積將光子信息重新分配到其來源，從而提供更好的焦平面中所需結(jié)構(gòu)的對比度。這可以使用戶更容易區(qū)分感興趣的結(jié)構(gòu)與背景，而不是使用傳統(tǒng)的寬場圖像。

圖 5：癌組織中的單分子 RNA-FISH。RNA-01（綠色），RNA-02（品紅色）左：原始數(shù)據(jù)。中：使用即時(shí)Computational Clearing。右：經(jīng)過大體積Computational Clearing處理。瑞士蘇黎世大學(xué)安德烈亞斯·摩爾教授提供。

你的預(yù)算是多少？

一個重要的問題是你能花多少錢。一些顯微鏡供應(yīng)商提供適合特定應(yīng)用的預(yù)定義配置。但是，如果你不需要你所支付的所有預(yù)配置組件呢？這就是為什么自由配置的組件可能比購買預(yù)定義顯微鏡系統(tǒng)更便宜。

此外，顯微鏡的要求可能會隨著時(shí)間而變化。在這種情況下，可升級系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢。使用預(yù)定義和固定配置，你可能會發(fā)現(xiàn)自己被限制在有限的應(yīng)用范圍內(nèi)?？缮壭宰屇阌凶杂呻S著需求的變化而成長。

考慮到這些因素，像徠卡顯微系統(tǒng)DMi8 這樣的模塊化顯微鏡平臺使研究人員能夠從一個負(fù)擔(dān)得起的顯微鏡系統(tǒng)開始，之后可以進(jìn)行升級，以滿足他的需求

圖 7：得益于其模塊化設(shè)計(jì)，徠卡 DMi8 可以根據(jù)研究人員的需求進(jìn)行配置。此外，如果需求發(fā)生變化，它還可以在后期進(jìn)行升級。

誰會使用顯微鏡？

顯微鏡用戶的范圍可以非常不均勻。尤其在大學(xué)，用戶可能非常有經(jīng)驗(yàn)或是初學(xué)者。因此，使用由直觀軟件驅(qū)動的易用顯微鏡系統(tǒng)，例如徠卡顯微系統(tǒng)應(yīng)用套件 X（LAS X），有助于快速入門并迅速獲取數(shù)據(jù)。例如，面向工作流程的設(shè)計(jì)、圖像分析向?qū)б约巴庠O(shè)的無縫集成簡化了您的工作。

除了寬場科研級顯微鏡，體視顯微鏡在生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室中也經(jīng)常使用。有關(guān)更多信息，請參閱文章“選擇體視顯微鏡時(shí)需要考慮的因素"。

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